Quelltext der Seite Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie

← Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie

Du bist aus dem folgenden Grund nicht berechtigt, die Seite zu bearbeiten:

Diese Aktion ist auf Benutzer beschränkt, die der Gruppe „Benutzer“ angehören.

Du kannst den Quelltext dieser Seite betrachten und kopieren.

[[Datei:TIRF.jpg|mini|Funktionsschema]]
'''Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie''' ({{enS|''total internal reflection fluorescence microscopy''}}, TIRFM) ist eine spezielle Methode der [[Lichtmikroskop]]ie, bei der die [[Fluoreszenz]] eines Präparats über ein [[Evaneszenz|evaneszentes]] (abklingendes) Feld angeregt wird. Zur Erzeugung des  [[Evaneszenz|evaneszenten]] Feldes wird Licht an der Innenseite eines Reflexionselement (z.&nbsp;B. ein [[Deckglas]] oder ein Reflexionsprisma) an der Grenzfläche zum Präparat [[Totalreflexion|totalreflektiert]]. Die Beschränkung auf Beobachtungen nahe dem Deckglas hat TIRF-Mikroskopie mit [[Interferenzreflexionsmikroskopie]] gemeinsam.

== Aufbau und Anwendung ==
Bei TIRFM wird ausgenutzt, dass Licht, das unter einem flachen Winkel auf eine Glas-Wasser-Grenzfläche fällt, total reflektiert wird. Im Wasser hinter dem Glas bildet sich dabei ein evaneszentes Feld aus (also ein Lichtfeld, dessen Intensität exponentiell in die Probe hinein abfällt) mit einer typischen [[Eindringtiefe]] für sichtbares Licht von 100–200&nbsp;nm. Befinden sich dort fluoreszierende [[Molekül]]e, die Licht der eingestrahlten Wellenlänge absorbieren können, so werden diese zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt. Dies führt zu einer sehr guten Begrenzung der erzeugten Fluoreszenz auf glasnahe Bereiche; die beobachtete Schicht ist nur 100–200&nbsp;nm dünn. Dadurch wird eine deutlich bessere Auflösung entlang der optischen Achse (z-Richtung) erzielt als bei normaler [[Fluoreszenzmikroskop]]ie oder [[Konfokalmikroskop]]ie (dort je über 500&nbsp;nm). Allerdings kann auch nur die Schicht direkt hinter dem Glas untersucht werden. 

Man verwendet typischerweise ein [[Lichtmikroskop#Aufrechte, umgekehrte oder inverse Mikroskope|inverses Lichtmikroskop]] mit einem [[Objektiv (Optik)|Objektiv]] mit [[Immersion (Mikroskopie)|Ölimmersion]] und sehr hoher [[Numerische Apertur|numerischer Apertur]], beispielsweise 1,45, um einen flachen Einstrahlwinkel erreichen zu können. Dabei wird entweder das Anregungslicht am Rand des Objektivs eingekoppelt, so dass es unter einem flachen Winkel auf das Deckglas fällt (Cis-TIRFM, linke Schemazeichnung), oder man verwendet ein zusätzliches Prisma, an dem sich ein evaneszentes Feld ausbildet (Trans-TIRFM, rechte Schemazeichnung). In der zweiten Realisierung sind die Anforderungen an das Objektiv nicht so hoch, da keine so hohe numerische Apertur benötigt wird.

{| class="centered"
|- style="vertical-align:top"
|[[File:Tirfm_numbers_like_TIRFM2.svg|thumb|none|(Cis-)Totalreflexions&shy;fluoreszenz&shy;mikroskopie, schematisch<br />1. Objektiv<br />2. Fluoreszenzlicht (zur Detektion)<br />3. Immersionsöl<br />4. Deckglas<br />5. Probe<br />6. evaneszentes Feld<br />7. Anregungslicht]]
|
[[Image:TIRFM2.svg|thumb|none|(Trans-)Totalreflexions&shy;fluoreszenz&shy;mikroskopie, schematisch<br />1. Objektiv<br />2. Fluoreszenzlicht (zur Detektion)<br />3. Immersionsöl<br />4. Deckglas<br />5. Probe<br />6. evaneszentes Feld<br />7. Anregungslicht<br />8. [[Quarz]]-[[Prisma (Optik)|Prisma]]]]
|}

== Anwendung ==
Die TIRF-Mikroskopie kann zur Untersuchung von Strukturen genutzt werden, die sich sehr nahe (ca. 200&nbsp;nm für sichtbares Licht) an einer Oberfläche befinden. Dies können fluoreszierende Moleküle in der [[Zellmembran|Membran einer Zelle]] oder nahe an dieser sein (siehe Bild oben). Bei klassischer [[Fluoreszenzmikroskopie]] würde das oberflächennahe Signal vom Hintergrundstreulicht überdeckt. TIRF eignet sich besonders zur Untersuchung von [[Exozytose]]. 

Bei Verwendung einer geeigneten Kamera ist TIRFM sensitiv genug, um einzelne fluoreszierende Moleküle zu detektieren. Die Methode wird daher auch benutzt, um einzelne, an einer Glasoberfläche gebundene Moleküle zu beobachten.

TIRFM kann auch in Verbindung mit [[Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie]] (dann als TIR-FCS bezeichnet) oder [[Einzelpartikelverfolgung|Single-Particle-Tracking]]-Techniken verwendet werden, um die Dynamik fluoreszierender Moleküle zu beobachten und zu quantifizieren.

==Literatur==
* {{Literatur
|Autor=N. L. Thompson, T. P. Burghardt, D. Axelrod
|Titel=Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy
|Sammelwerk=Biophys J.|Band=33|Nummer=3|Jahr=1981|Seiten=435–454|DOI=10.1016/S0006-3495(81)84905-3|PMC=1327440}}

[[Kategorie:Lichtmikroskop-Art oder lichtmikroskopisches Verfahren]]
[[Kategorie:Biophysikalische Methode]]

Zurück zur Seite Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie.

Abgerufen von „https://www.cosmos-indirekt.de/Physik-Schule/Interne_Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie“