Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie: Unterschied zwischen den Versionen

Aktuelle Version vom 9. Dezember 2021, 13:16 Uhr

Vergleich der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie (A,D) mit der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (B,E) samt zugehöriger Verteilung der Fluoreszenzlebensdauern (C,F).
Die Aufnahmen zeigen eingefärbte Zellkerne.
Die Abnahme der Fluoreszenzlebensdauern in der unteren Reihe, bedingt durch die Zugabe eines weiteren Fluoreszenzfarbstoffes, deutet auf einen Förster-Resonanzenergietransfer hin.

Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (englisch fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) ist ein Fluoreszenz-basiertes bildgebendes Verfahren der Mikroskopie. Im Gegensatz zu anderen fluoreszenzmikroskopischen Verfahren beruht sie nicht auf einer Messung der Fluoreszenzintensität, sondern auf der Messung der unterschiedlichen Lebensdauern der angeregten Zustände fluoreszierender Moleküle.

Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie wird insbesondere in Verbindung mit der Konfokalmikroskopie und der Multiphotonenmikroskopie angewendet.

Physikalische Grundlage

Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie beruht auf einer Messung der Fluoreszenzlebensdauer angeregter fluoreszierender Moleküle. Die Fluoreszenzlebensdauer ist dabei die mittlere Zeit $\tau$ , die ein Molekül im angeregten Zustand verbleibt, bevor es unter Abgabe eines Photons in seinen Grundzustand zurückkehrt. Der Fluoreszenzabbau spiegelt sich in einer exponentiellen Abnahme der Fluoreszenzintensität $$ I $$ mit der Zeit t wieder:

I(t)=I_{0}\exp \left(-{\frac {t}{\tau }}\right)

mit

der initialen Fluoreszenzintensität $I_{0}$ zur Zeit $$ t=0 $$ .

Zugleich ist die Fluoreszenzlebensdauer umgekehrt proportional zur Summe der Zerfallsraten k für strahlende und nichtstrahlende Prozesse:

{\frac {1}{\tau }}=\sum k_{i}

Die Fluoreszenzlebensdauer eines Farbstoffs hängt u. a. ab von seiner Identität und seiner chemischen Umgebung. Sie wird durch Energietransfermechanismen wie den Förster-Resonanzenergietransfer beeinflusst. Die Fluoreszenzlebensdauer ist jedoch unabhängig von der initialen Fluoreszenzintensität.

Verfahren

Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie liefert Bilder mit der Fluoreszenzlebensdauer für jedes Pixel des Bildes. Die Messung der Fluoreszenzlebensdauer in der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie beruht entweder auf einer gepulsten Anregung und einer Messung des zeitlichen Fluoreszenzabfalls, oder auf einer intensitätsmodulierten Anregung und einer Messung der Phasenverschiebung.

Gepulste Anregung

Die theoretisch einfachste Methode zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer besteht in der Zählung freigesetzter Photonen mit Hilfe der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (englisch time-correlated single photon counting, TCSPC), nach periodischer Anregung mit kurzen Lichtimpulsen im Picosekundenbereich, also deutlich kürzer als typische Fluoreszenzlebensdauern (Nanosekundenbereich).

Bei ausreichend kurzer Anregung kann dann für die meisten Proben die zeitabhängige exponentielle Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet werden, aus der die Fluoreszenzlebensdauer bestimmt werden kann. Dazu wird die Anregungsintensität soweit herabgesetzt, dass pro Anregungspuls nur etwa ein Photon detektiert wird. Für dieses lässt sich die Zeit zwischen Anregungspuls und Photon mit einer Genauigkeit von einigen Picosekunden messen. Aus vielen solchen Einzelmessungen wird dann ein Histogramm erstellt, aus dem die Fluoreszenzlebensdauer direkt bestimmt werden kann.

Dieses Verfahren hat außerdem den Vorteil, dass es von Schwankungen der Anregungsintensität unabhängig ist.

Phasenmodulierung

Mit Hilfe der Phasenfluorimetrie kann die Fluoreszenzlebensdauer über die Phasenverschiebung der Fluoreszenz nach einer intensitätsmodulierten Anregung bestimmt werden. Die Anregungsintensität $$ E $$ (engl. excitation: Anregung) wird hierbei sinusförmig moduliert, z. B. mit Hilfe eines akustooptischen Modulators:

E(t)=E_{0}\cdot (1+m_{\text{E}}\cdot \sin(\omega t))

mit

der Kreisfrequenz ω der Modulation
der Amplitude m_E der Modulation.

Das Signal $$ F $$ der Fluoreszenzintensität folgt dem Anregungssignal zeitversetzt:

F(t,{\vec {r}})=F_{0}({\vec {r}})\cdot {\bigl (}1+m_{\text{F}}({\vec {r}})\cdot \sin[\omega t+\varphi _{\text{F}}({\vec {r}})]{\bigr )}

mit

dem Ort ${\vec {r}}={\binom {x}{y}}$ der Detektion, also dem Pixel x, y
dem Versatz (als Phase φ_F), der den zeitlich begrenzten Verbleib des Fluoreszenzfarbstoffs im angeregten Zustand beschreibt
der Modulationsamplitude m_F, die gegenüber m_E reduziert ist.

Die Fluoreszenzlebensdauer kann dann auf zwei Arten bestimmt werden:

über die Phase: $\tau ({\vec {r}})={\frac {1}{\omega }}\cdot \tan {\varphi _{\text{F}}({\vec {r}})}$
über die Amplitudenänderung: $\tau ({\vec {r}})={\frac {1}{\omega }}\cdot {\sqrt {\left({\frac {m_{\text{E}}}{m_{\text{F}}}}\right)^{2}-1}}$ .

Zur Detektion können hier Bildsensoren (CCD-Kameras, Avalanche-Photodioden-Felder^[1]) eingesetzt werden, bei denen die Zeit, in der sie sensitiv sind, fein gesteuert werden kann. Bei ICCD-Kameras erfolgt dies z. B. über Bildverstärker aus Mikrokanalplatten, deren Verstärkung durch dasselbe Signal moduliert werden kann, das zur Steuerung der Beleuchtung benutzt wird ({{Modul:Vorlage:lang}} Modul:Multilingual:149: attempt to index field 'data' (a nil value)). Dann werden Aufnahmen gemacht, bei denen Detektion und Anregung unterschiedlich zueinander phasenverschoben sind; aus diesen wird ein Bild der Fluoreszenzlebensdauern rekonstruiert.^[2]

Literatur

Theodorus W. J. Gadella: FRET and FLIM techniques. Elsevier, Amsterdam 2009, ISBN 978-0-08-054958-3.
A. Periasamy, R. M. Clegg: Flim Microscopy in Biology and Medicine. CRC Press, 2010, ISBN 978-1-4200-7890-9.

Weblinks

Applications in Confocal Microscopy: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM). Olympus Corporation, archiviert vom Original am 20. Dezember 2011; abgerufen am 3. April 2010 (Lua-Fehler in Modul:Multilingual, Zeile 149: attempt to index field 'data' (a nil value)).
Application Note: Two-photon fluorescence lifetime imaging (2P-FLIM) for ion sensing in living cells (PDF; 831 kB) PicoQuant GmbH 2008
Application Note: Quantitative in vivo imaging of molecular distances using FLIM-FRET (PDF; 764 kB) PicoQuant GmbH 2009
Principle of TCSPC FLIM (Becker & Hickl, website)
Molecular Imaging with FLIM (Becker & Hickl, website)

Einzelnachweise

↑ Day-Uei Li, Jochen Arlt, Justin Richardson, Richard Walker, Alex Buts, David Stoppa, Edoardo Charbon, Robert Henderson: Real-time fluorescence lifetime imaging system with a 32 × 32 0.13µm CMOS low dark-count single-photon avalanche diode array. In: Optics Express. Band 18, Nr. 10, 2010, ISSN 1094-4087, S. 10257–10269, doi:10.1364/OE.18.010257.
↑ Joseph R. Lakowicz, Klaus W. Berndt: Lifetime-selective fluorescence imaging using an rf phase-sensitive camera. In: Review of Scientific Instruments. Band 62, Nr. 7, 1991, ISSN 0034-6748, S. 1727, doi:10.1063/1.1142413.

[DOI10.1364/OE.18.010257-1] Day-Uei Li, Jochen Arlt, Justin Richardson, Richard Walker, Alex Buts, David Stoppa, Edoardo Charbon, Robert Henderson: Real-time fluorescence lifetime imaging system with a 32 × 32 0.13µm CMOS low dark-count single-photon avalanche diode array. In: Optics Express. Band 18, Nr. 10, 2010, ISSN 1094-4087, S. 10257–10269, doi:10.1364/OE.18.010257.

[DOI10.1063/1.1142413-2] Joseph R. Lakowicz, Klaus W. Berndt: Lifetime-selective fluorescence imaging using an rf phase-sensitive camera. In: Review of Scientific Instruments. Band 62, Nr. 7, 1991, ISSN 0034-6748, S. 1727, doi:10.1063/1.1142413.

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-{{QS-Physik|Unerledigt=2012|Fluoreszenzlebensdauer}}
+[[Datei:FLIM-mKO-mCherry.png|mini|250px|Vergleich der konventionellen Fluoreszenz&shy;mikroskopie&nbsp;(A,D) mit der Fluoreszenz&shy;''lebensdauer''-Mikroskopie&nbsp;(B,E) samt zugehöriger Verteilung der Fluoreszenz&shy;lebensdauern&nbsp;(C,F).<br />Die Aufnahmen zeigen eingefärbte [[Zellkern]]e.<br />Die Abnahme der Fluoreszenz&shy;lebensdauern in der unteren Reihe, bedingt durch die Zugabe eines weiteren Fluoreszenz&shy;farbstoffes, deutet auf einen [[Förster-Resonanzenergietransfer|Förster-Resonanzenergie&shy;transfer]] hin.]]
+Die '''Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie''' ({{enS|''fluorescence lifetime imaging microscopy''}},&nbsp;'''FLIM''') ist ein [[Fluoreszenz]]-basiertes [[bildgebendes Verfahren]] der [[Mikroskopie]]. Im Gegensatz zu anderen [[Fluoreszenzmikroskopie|fluoreszenzmikroskopischen]] Verfahren beruht sie ''nicht'' auf einer Messung der Fluoreszenzintensität, sondern auf der Messung der unterschiedlichen [[Fluoreszenzlebensdauer|Lebensdauern]] der [[angeregter Zustand|angeregten Zustände]] fluoreszierender [[Molekül]]e.
-[[Datei:FLIM-mKO-mCherry.png|mini|Vergleich der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie (A,D) mit der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (B,E) mit der dazugehörigen Verteilung der Fluoreszenzlebensdauern (C,F). Die Aufnahmen zeigen eingefärbte Zellkerne und die Abnahme der Fluoreszenzlebensdauern in den Abbildungen C–F, bedingt durch die Zugabe eines weiteren Fluoreszenzfarbstoffes, deutet auf einen [[Förster-Resonanzenergietransfer]] hin.]]
+Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie wird insbesondere in Verbindung mit der [[Konfokalmikroskopie]] und der [[Multiphotonenmikroskopie]] angewendet.
-Die '''Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie''' ({{enS|''fluorescence lifetime imaging microscopy''}}, '''FLIM''') ist ein [[Fluoreszenz]]-basiertes [[bildgebendes Verfahren]] der [[Mikroskopie]]. Im Gegensatz zu anderen [[Fluoreszenzmikroskopie|fluoreszenzmikroskopischen]] Verfahren beruht die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie nicht auf einer Messung der Fluoreszenzintensität, sondern auf der Messung der unterschiedlichen [[Fluoreszenzlebensdauer|Lebensdauern]] der angeregten Zustände fluoreszierender [[Molekül]]e. Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie wird insbesondere in Verbindung mit der [[Konfokalmikroskopie]] und der [[Multiphotonenmikroskopie]] angewendet.
-== Physik ==
+== Physikalische Grundlage ==
-Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie beruht auf einer Messung der [[Fluoreszenzlebensdauer]] angeregter fluoreszierender Moleküle. Die Fluoreszenzlebensdauer ist dabei die mittlere Zeit <math>\tau\!\,</math>, die ein Molekül im angeregten Zustand verbleibt, bevor es unter Abgabe eines Photons in seinen Grundzustand zurückkehrt. Der Fluoreszenzabbau spiegelt sich in einer exponentiellen Abnahme der [[Strahlungsintensität|Fluoreszenzintensität]] <math>I</math> mit der Zeit ''t'' wider:
+{{Hauptartikel|Fluoreszenzlebensdauer}}
+Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie beruht auf einer Messung der [[Fluoreszenzlebensdauer]] angeregter fluoreszierender Moleküle. Die Fluoreszenzlebensdauer ist dabei die mittlere Zeit <math>\tau</math>, die ein Molekül im angeregten Zustand verbleibt, bevor es unter Abgabe eines [[Photon]]s in seinen [[Grundzustand]] zurückkehrt. Der Fluoreszenzabbau spiegelt sich in einer [[Exponentieller Prozess#Exponentielle Abnahme|exponentiellen Abnahme]] der [[Strahlungsintensität|Fluoreszenzintensität]] <math>I</math> mit der Zeit&nbsp;''t'' wieder:
-: <math>I(t)=I_0 \exp \left(-\frac{t}{\tau}\right) </math>.
+:<math>I(t) = I_0 \exp \left( -\frac t{\tau} \right)</math>
-Zugleich ist die Fluoreszenzlebensdauer umgekehrt proportional zur Summe der Zerfallsraten ''k'' für strahlende und nichtstrahlende Prozesse.
+mit
+* der initialen Fluoreszenzintensität <math>I_0</math> zur Zeit <math>t = 0</math>.
-:<math>\frac{1}{\tau} = \sum k_i</math>
+Zugleich ist die Fluoreszenzlebensdauer [[umgekehrt proportional]] zur Summe der Zerfallsraten&nbsp;''k'' für strahlende und nichtstrahlende Prozesse:
-Die Fluoreszenzlebensdauer eines Farbstoffs ist unter anderem von seiner Identität und seiner chemischen Umgebung abhängig. Sie wird durch Energietransfermechanismen, wie dem [[Förster-Resonanzenergietransfer]], beeinflusst. Die Fluoreszenzlebensdauer ist jedoch unabhängig von der initialen Fluoreszenzintensität.
+:<math>\frac 1{\tau} = \sum k_i</math>
-== Messung ==
+Die Fluoreszenzlebensdauer eines [[Farbstoff]]s hängt u.&nbsp;a. ab von seiner Identität und seiner chemischen Umgebung. Sie wird durch Energietransfermechanismen wie den [[Förster-Resonanzenergietransfer]] beeinflusst. Die Fluoreszenzlebensdauer ist jedoch unabhängig von der initialen Fluoreszenzintensität.
-Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie liefert Bilder mit der Fluoreszenzlebensdauer für jedes [[Pixel]] des Bildes. Die Messung der Fluoreszenzlebensdauer in der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie beruht entweder auf einer gepulsten Anregung und einer Messung des zeitlichen Fluoreszenzabfalls, oder auf einer intensitätsmodulierten Anregung und einer Messung der [[Phasenverschiebung]].
+== Verfahren ==
+Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie liefert Bilder mit der Fluoreszenzlebensdauer für jedes [[Pixel]] des Bildes. Die Messung der Fluoreszenzlebensdauer in der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie beruht entweder auf einer gepulsten Anregung und einer Messung des zeitlichen Fluoreszenzabfalls, oder auf einer intensitäts[[Modulation (Technik)|modulierten]] Anregung und einer Messung der [[Phasenverschiebung]].
 === Gepulste Anregung ===
-Die theoretisch einfachste Methode zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer besteht in der Zählung freigesetzter Photonen mit Hilfe der [[Zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung|zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung]] (TCSPC), nach periodischer Anregung mit kurzen Lichtimpulsen im Picosekundenbereich, also deutlich kürzer als typische Fluoreszenzlebensdauern (Nanosekundenbereich). Bei ausreichend kurzer Anregung kann dann für die meisten Proben die zeitabhängige exponentielle Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet werden, aus der die Fluoreszenzlebensdauer bestimmt werden kann. Dazu wird die Anregungsintensität soweit herabgesetzt, dass pro Anregungspuls nur etwa ein Photon detektiert wird. Für dieses lässt sich die Zeit zwischen Anregungspuls und Photon mit einer Genauigkeit von einigen Picosekunden messen. Aus vielen solchen Einzelmessungen wird dann ein Histogramm erstellt, aus dem die Fluoreszenzlebensdauer direkt bestimmt werden kann. Dieses Verfahren hat außerdem den Vorteil, dass es von Schwankungen der Anregungsintensität unabhängig ist.
+{{Hauptartikel|Zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung}}
+Die theoretisch einfachste Methode zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer besteht in der Zählung freigesetzter Photonen mit Hilfe der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (englisch ''time-correlated single photon counting'', TCSPC), nach periodischer Anregung mit kurzen Lichtimpulsen im [[Picosekunde]]nbereich, also deutlich kürzer als typische Fluoreszenzlebensdauern ([[Nanosekunde]]nbereich).
+Bei ausreichend kurzer Anregung kann dann für die meisten Proben die zeitabhängige exponentielle Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet werden, aus der die Fluoreszenzlebensdauer bestimmt werden kann. Dazu wird die Anregungsintensität soweit herabgesetzt, dass pro Anregungspuls nur etwa ''ein'' Photon detektiert wird. Für dieses lässt sich die Zeit zwischen Anregungspuls und Photon mit einer Genauigkeit von einigen Picosekunden messen. Aus vielen solchen Einzelmessungen wird dann ein [[Histogramm]] erstellt, aus dem die Fluoreszenzlebensdauer direkt bestimmt werden kann.
+Dieses Verfahren hat außerdem den Vorteil, dass es von Schwankungen der Anregungsintensität unabhängig ist.
 === Phasenmodulierung ===
-Mit Hilfe der [[Phasenfluorimetrie]] kann die Fluoreszenzlebensdauer über die Phasenverschiebung der Fluoreszenz nach einer intensitätsmodulierten Anregung bestimmt werden. Die Anregungsintensität wird hierbei [[Sinus|sinusförmig]], beispielsweise mit Hilfe eines [[Akustooptischer Modulator|akustooptischen Modulators]] moduliert:
+Mit Hilfe der [[Fluoreszenzlebensdauer#Phasenfluorometrie|Phasenfluorimetrie]] kann die Fluoreszenzlebensdauer über die Phasenverschiebung der Fluoreszenz nach einer intensitätsmodulierten Anregung bestimmt werden. Die Anregungsintensität <math>E</math> (engl. ''excitation'': Anregung) wird hierbei [[sinus]]förmig moduliert, z.&nbsp;B. mit Hilfe eines [[Akustooptischer Modulator|akustooptischen Modulators]]:
-:<math>E(t)=E_0\cdot(1+m_\text{E}\cdot\sin(\omega t))</math>
-Dabei ist ''ω'' die Kreisfrequenz der Modulation und ''m''<sub>E</sub> die Modulationsamplitude.
+:<math>E(t) = E_0 \cdot (1 + m_\text{E} \cdot \sin(\omega t))</math>
+mit
+* der [[Kreisfrequenz]]&nbsp;''ω'' der Modulation
+* der [[Amplitude]]&nbsp;''m''<sub>E</sub> der Modulation.
+Das Signal <math>F</math> der Fluoreszenzintensität folgt dem Anregungssignal zeitversetzt:
+:<math>F(t,\vec{r}) = F_0(\vec{r}) \cdot \bigl(1 + m_\text{F}(\vec{r}) \cdot \sin[\omega t + \varphi_\text{F}(\vec{r})]\bigr)</math>
-Das Fluoreszenzsignal folgt dem Anregungssignal zeitversetzt:
+mit
-:<math>F(t,\vec{r})=F_0(\vec{r})\cdot\bigl(1+m_\text{F}(\vec{r})\cdot\sin[\omega t+\varphi_\text{F}(\vec{r})]\bigr)</math>
+* dem Ort <math>\vec{r} = \binom x y</math> der Detektion, also dem Pixel&nbsp;''x,&nbsp;y''
-Hierbei bezeichnet <math>\vec{r}=(x,y)^t</math> den Ort der Detektion, also den Pixel ''x, y''. Der Versatz (als Phase ''φ''<sub>F</sub>) spiegelt den zeitlich begrenzten Verbleib des Fluoreszenzfarbstoffs in seinem angeregten Zustand wider. Zudem wird die Modulationsamplitude ''m''<sub>F</sub> des Signals reduziert. Die Fluoreszenzlebensdauer kann dann auf zwei Arten bestimmt werden:
+* dem Versatz (als [[Phasenwinkel|Phase]]&nbsp;''φ''<sub>F</sub>), der den zeitlich begrenzten Verbleib des Fluoreszenzfarbstoffs im angeregten Zustand beschreibt
+* der Modulationsamplitude&nbsp;''m''<sub>F</sub>, die gegenüber&nbsp;''m''<sub>E</sub> reduziert ist.
-:über die Phase: <math>\tau(\vec{r}) = \frac{1}{\omega}\cdot \tan {\varphi_\text{F}(\vec{r})} \!</math>
+Die Fluoreszenzlebensdauer kann dann auf zwei Arten bestimmt werden:
-:bzw. über die Amplitudenänderung: <math>\tau(\vec{r}) =\frac{1}{\omega}\cdot \sqrt {\left(\frac{m_\text{F}}{m_\text{E}}\right)^{2}-1} \!</math>
+* über die Phase: <math>\tau(\vec{r}) = \frac 1{\omega} \cdot \tan {\varphi_\text{F}(\vec{r})}</math>
+* über die Amplitudenänderung: <math>\tau(\vec{r}) = \frac 1{\omega} \cdot \sqrt{ \left( \frac{m_\text{E}}{m_\text{F}} \right)^{2}-1}</math>.
-Zur Detektion können hier Bildsensoren ([[CCD-Kamera|CCD-Kameras]], [[Avalanche-Photodiode#Einzelphotonenzählung|Avalanche-Photodioden-Felder]]<ref name="DOI10.1364/OE.18.010257">{{Literatur |Autor=Day-Uei Li, Jochen Arlt, Justin Richardson, Richard Walker, Alex Buts, David Stoppa, Edoardo Charbon, Robert Henderson |Titel=Real-time fluorescence lifetime imaging system with a 32 × 32 0.13µm CMOS low dark-count single-photon avalanche diode array |Sammelwerk=Optics Express |Band=18 |Nummer=10 |Datum=2010 |ISSN=1094-4087 |Seiten=10257-10269 |DOI=10.1364/OE.18.010257}}</ref>) eingesetzt werden, bei denen die Zeit in der sie sensitiv sind, fein gesteuert werden kann. Bei [[Intensified charge-coupled device|ICCD]]-Kameras erfolgt dies z.&nbsp;B. über Bildverstärker aus [[Mikrokanalplatte]]n, deren Verstärkung durch dasselbe Signal, das zur Steuerung der Beleuchtung benutzt wird, moduliert werden kann ({{lang|en|''gated CCD''}}). Es werden dann Aufnahmen gemacht, bei denen die Detektion und Anregung unterschiedlich zueinander phasenverschoben sind. Aus diesen wird dann ein Bild der Fluoreszenzlebensdauern rekonstruiert<ref name="DOI10.1063/1.1142413">{{Literatur |Autor=[[Joseph R. Lakowicz]], Klaus W. Berndt |Titel=Lifetime-selective fluorescence imaging using an rf phase-sensitive camera |Sammelwerk=Review of Scientific Instruments |Band=62 |Nummer=7 |Datum=1991 |ISSN=0034-6748 |Seiten=1727 |DOI=10.1063/1.1142413}}</ref>.
+Zur [[Detektion]] können hier Bildsensoren ([[CCD-Kamera]]s, [[Avalanche-Photodiode#Einzelphotonenzählung|Avalanche-Photodioden-Felder]]<ref name="DOI10.1364/OE.18.010257">{{Literatur |Autor=Day-Uei Li, Jochen Arlt, Justin Richardson, Richard Walker, Alex Buts, David Stoppa, Edoardo Charbon, Robert Henderson |Titel=Real-time fluorescence lifetime imaging system with a 32 × 32 0.13µm CMOS low dark-count single-photon avalanche diode array |Sammelwerk=Optics Express |Band=18 |Nummer=10 |Datum=2010 |ISSN=1094-4087 |Seiten=10257-10269 |DOI=10.1364/OE.18.010257}}</ref>) eingesetzt werden, bei denen die Zeit, in der sie sensitiv sind, fein gesteuert werden kann. Bei [[Intensified charge-coupled device|ICCD]]-Kameras erfolgt dies z.&nbsp;B. über [[Bildverstärker]] aus [[Mikrokanalplatte]]n, deren Verstärkung durch dasselbe Signal moduliert werden kann, das zur Steuerung der Beleuchtung benutzt wird ({{lang|en|''gated CCD''}}). Dann werden Aufnahmen gemacht, bei denen Detektion und Anregung unterschiedlich zueinander phasenverschoben sind; aus diesen wird ein Bild der Fluoreszenzlebensdauern rekonstruiert.<ref name="DOI10.1063/1.1142413">{{Literatur |Autor=[[Joseph R. Lakowicz]], Klaus W. Berndt |Titel=Lifetime-selective fluorescence imaging using an rf phase-sensitive camera |Sammelwerk=Review of Scientific Instruments |Band=62 |Nummer=7 |Datum=1991 |ISSN=0034-6748 |Seiten=1727 |DOI=10.1063/1.1142413}}</ref>
 == Literatur ==
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     |archiv-datum=2011-12-20
     |sprache=en}}
-* [http://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7269/appnote_twophotonexcitation.pdf ''Application Note: Two-photon fluorescence lifetime imaging (2P-FLIM) for ion sensing in living cells''] (PDF; 537&nbsp;kB) PicoQuant GmbH 2008
+* [http://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7269/appnote_twophotonexcitation.pdf ''Application Note: Two-photon fluorescence lifetime imaging (2P-FLIM) for ion sensing in living cells''] (PDF; 831&nbsp;kB) PicoQuant GmbH 2008
-* [http://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7267/appnote_flim_fret.pdf ''Application Note: Quantitative in vivo imaging of molecular distances using FLIM-FRET''] (PDF; 636&nbsp;kB) PicoQuant GmbH 2009
+* [http://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7267/appnote_flim_fret.pdf ''Application Note: Quantitative in vivo imaging of molecular distances using FLIM-FRET''] (PDF; 764&nbsp;kB) PicoQuant GmbH 2009
+* [https://www.becker-hickl.com/applications/tcspc-flim/ Principle of TCSPC FLIM] (Becker & Hickl, website)
+* [https://www.becker-hickl.com/applications/molecular-imaging/ Molecular Imaging with FLIM] (Becker & Hickl, website)
 == Einzelnachweise ==